■ 产品简介

EdU-647细胞增殖检测试剂盒，是一种简单快速而灵敏的检测细胞增殖的试剂盒。EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子中，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针通过一价铜离子的催化发生共价反应，使EdU被探针所标记，新合成的DNA会被相应的荧光探针标记，从而可以通过适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞。本试剂盒可用于培养细胞及组织切片的检测。

■ 试剂盒组份

■ 保存条件

4˚C储存，一年有效。荧光试剂须避光保存。

■ 其他所需试剂

1.10 mM PBS，pH7.4；

2.细胞固定液（4%多聚甲醛溶液）；

3.透膜液（0.2%Triton X-100），PBS稀释；

4.根据实验要求：细胞爬片，载玻片，12孔细胞培养板或其它多孔板，或流式细胞分析管（如12×75 mm）。

■ 检测方法

1.细胞培养（贴壁细胞）

每孔0.5×105~1×106细胞接种于12孔板中，细胞正常生长且密度不超过80%为宜。

EdU标记

1.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液与培养基是等体积加入到孔板中，所以需要配制2X的EdU工作液。用培养液以1:500的比例稀释EdU溶液（试剂A）即可得到2X的EdU工作液（100 μM）。将等体积的2X EdU工作液加至12孔板中，使12孔板EdU的终浓度为1X（50 μM）。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有

影响，因此不建议替换所有的培养液。

2.继续培养2小时。注：不同种类细胞的EdU孵育时间不同，具体参考如下表：

表2. EdU孵育时间参考对照表

表3. EdU培养基及染色反应液的使用量参考

EdU检测

1.EdU标记完成后，去除培养基，用PBS洗涤细胞1次。

2.每孔加入0.5 ml细胞固定液，室温固定10分钟。

3.去除固定液，用PBS洗涤细胞2次。

4.去除PBS，每孔加0.5 ml 0.2%TritonX-100透膜液，室温孵育10分钟。

5.去除透膜液，用PBS洗涤细胞2次。

6.配制缓冲添加剂溶液：用1.3 ml去离子水溶解一管缓冲添加剂（试剂E），混匀至全部溶解，即为缓冲添加剂溶液。配制后可以适当分装，并-20ºC保存。缓冲添加剂溶液在使用过程中如果出现变色成棕色，则弃用。

7.参照表4顺序进行EdU反应液的配制：

表4. EdU反应液的配制参考

注：按顺序配制适量EdU反应液，现用现配，30分钟内使用

8.去除PBS，每孔加入500 μl的EdU反应液，室温避光孵育30分钟。

9.去除反应液，用PBS洗涤细胞2-3次。

10.染核，用PBS以1：500比例稀释Hoechst 33342（试剂F）配成染色工作液，每孔加入500 μl染色工作液，室温避光染色5-10分钟。

11.去除染色液，用PBS洗涤细胞2次。

12.荧光显微镜检测。Azide 647的最大激发波长是648 nm，最大发射波长是664 nm。Hoechst 33342的最大激发波长为346 nm，最大发射波长为460 nm。Hoechst 33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350 nm，最大

发射波长为461 nm。

2.组织切片：动物体内EdU的标记及切片样品的处理

a.动物体内EdU的标记可参考相关文献，对于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中，初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索。

b.标记4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。

c.对于冰冻切片:

1)可在组织周围用组化笔画圈，每个圈中滴加适量固定液，室温固定15分钟。

2)去除固定液，用PBS洗涤2-3次，每次3分钟。

3)去除PBS，滴加适量透膜液室温孵育10-15分钟。

4)去除透膜液，用PBS洗涤2次，每次3分钟。

d.对于石蜡切片:

1)脱蜡:二甲苯脱蜡5-10分钟，换用新的二甲苯脱蜡5-10分钟。无水乙醇2分钟，换新的无水乙醇2分钟。90%乙醇2分钟。80%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟。PBS5分钟。

2)去除PBS，滴加适量透膜液室温孵育10-15分钟。

3)去除透膜液，用PBS洗涤2次，每次3分钟。

EdU检测

a.配制缓冲添加剂溶液：用1.3 ml去离子水溶解一管缓冲添加剂（试剂E），混匀至全部溶解，即为缓冲添加剂溶液。配制后可以适当分装，并-20ºC保存。缓冲添加剂溶液在使用过程中如果出现变色成棕色，则弃用。

b.参照表4顺序进行EdU反应液的配制。

c.去除PBS，每个圈中滴加适量EdU反应液，室温避光孵育30分钟。

d.去除反应液，用PBS洗涤3次，每次3-5分钟。

e.染核，用PBS以1：500比例稀释Hoechst 33342（试剂F）配成染色工作液，每个圈中滴加适量染色工作液，室温避光染色5-10分钟。

f.去除染色液，用PBS洗涤2次。

g.用甘油或防荧光淬灭剂封片。

h.荧光显微镜检测。

■ 注意事项

1.EdU使用浓度说明：本试剂盒推荐使用50 μM浓度孵育2小时，由于细胞类型、细胞密度以及细胞增殖速度都会影响细胞DNA复制过程中EdU的掺入，因此建议首次实验时对EdU的使用浓度进行一定的摸索，以达到更好的实验效果；同时，可设不加EdU的阴性对照组，以便进行染料背景分析。

2.组织切片染色过程中需防止干片，导致背景过强影响实验结果。

3.试剂使用前恢复至室温，并瞬时离心。

4.实验过程请注意个人防护，请穿实验服及佩戴口罩。

5.本产品仅用于科学研究，不用于临床诊断。