■ 产品描述

人CD8+T细胞分选试剂盒是通过阴性分选法从人外周血单个核细胞（PBMC）中分离出 CD8+T细胞。原理是利用生物素（biotin）标记的单克隆抗体对非目标细胞（非CD8+T细胞）进行标记，然后通过链霉亲和素（streptavidin）标记的磁珠对非目标细胞进行清除，从而达到纯化人CD8+T细胞的目的。分选过程需要用到磁力架。

■ 产品组分

■ 储存条件

2-8°C保存，不可冷冻，有效期见试管标签。

■ 适用范围

本试剂盒适用于从新鲜分离的人 PBMC 或冻存的人 PBMC 中分选出CD8+T细胞。

■ 操作流程

1.制备人PBMC：利用 Ficoll 密度梯度离心法从人外周血中分离 PBMC，收集 PBMC，以 PBS 洗涤细胞，离心后将 PBMC 重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为 1×10^8 cells/mL。

注意：分选buffer为含有2% FBS和2mM EDTA的PBS ，缓冲液应该不含Ca2+和Mg2+ ，需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌。

2. 抗体标记非目的细胞：将 100 μL 细胞悬液（ 1×10^7个细胞）加入一个无菌 1.5 mL 离心管底部，再加入 2 μL Biotin-Antibody Mix，混匀后 4°C 孵育 15 min。加入1 mL（10倍体积）分选buffer，500 g离心5分钟，弃上清，用100 μL缓冲液重悬细胞。

注意：按比例调整用量：如5×10⁷ cells需500 μL细胞悬液 + 10 μL抗体，用5 mL分选buffer洗涤。可以使用 15 mL 或 50 mL 离心管进行操作。

3. 磁珠预处理：涡旋震荡重悬磁珠（Streptavidin-beads），吸取20 μL磁珠至1.5 mL离心管，加入1 mL分选buffer，10000 g离心1 min，弃上清。重复洗涤1次。清洗后用20 μL分选buffer进行重悬。

注意：buffer与磁珠最终是1:1等比例混匀，如清洗50 μL磁珠（Streptavidin-beads），则最终用50 μL buffer重悬。

4. 磁珠孵育：加入10 μL预处理过的Streptavidin-beads混悬液，轻轻混匀，4℃孵育10分钟。

注意：说明书以1×10^7个细胞量举例，如果分选更多细胞，则按比例增加Streptavidin-beads用量。

5. 磁力分离：孵育完成后，将细胞和磁珠混合液转移至一个无菌5 mL流式管中，补加分选 buffer 至总体积为 2.5 mL，用移液器吹打5次混匀。将流式管置于磁力架上静置5分钟。

注意：流式管选用聚苯乙烯材质。

6. 收集细胞 ：手持磁力架，将细胞悬液轻柔倒入无菌离心管中，此细胞悬液中即包含纯化的人CD8+T细胞。

注意：倾倒过程中流式管不要脱离磁力架。

7.二次纯化（可选*）：将收集的细胞悬液离心，500 g离心5 min后，弃上清，用 100 μL 分选 buffer 重悬细胞，重复步骤4-6，此操作可提高纯度2-4%。

■ 注意事项

1.磁珠和抗体混合液使用和保存过程中均应避免冷冻、高速离心等操作；

2.建议选用低吸附移液器吸头和离心管，避免因吸附造成磁珠和抗体的损耗；

3.如果单次分选少于1×10^7 cells，则将细胞悬液体积补至100 μL ，加入2 μL Biotin-Antibody Mix和10 μL Streptavidin-Beads；

4.本产品需与磁性分离器配套使用；

5.本产品仅供研究使用。

■ 分选效果

从人 PBMC 中分选CD8+T 细胞，用 PE 标记的 anti-human CD8a 抗体（克隆号 RPA-T8）和 APC 标记的 anti-human CD3 抗体（克隆号 OKT3）染色后进行流式细胞分析，分选前后的 CD3+CD8+T细胞纯度分别为 15.3%和 91.5%。