■ 产品描述

人 CD3/CD28 T 细胞激活磁珠可以简单快捷的活化及扩增 T 细胞，无需饲养层细胞（抗原递呈细胞）或抗原。磁珠为直径 5 µm 的惰性超顺磁珠，大小与抗原呈递细胞相似，同时共价偶联抗 CD3 和抗 CD28 抗体。细胞培养过程中可使用重组人 IL-2 刺激 T 细胞群扩增。活化或扩增后，磁珠可以通过磁力架轻松去除。

■ 产品组分

■ 储存条件

2-8°C保存，不可冷冻，有效期见试管标签。

■ 适用范围

本试剂盒适用于外周血单核细胞（PBMC)或 T细胞亚群：包括CD3+ T 细胞、CD4+ T 细胞或      CD8+ T 细胞。

■ 实验试剂准备

1.清洗buffer：含2 mM EDTA和2%胎牛血清（FBS）的PBS，或含2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS，需经0.22 μm滤膜过滤除菌。

2. 细胞培养基：

基础培养基：RPMI 1640，含2 mM L-谷氨酰胺和10% FBS或商品化T细胞扩增培养基。

可选添加：100 U/mL青霉素-链霉素（双抗）。

扩增培养基：添加30 U/mL重组人IL-2。

■ 操作流程

一.磁珠预处理：

1. 涡旋磁珠30 秒以上，彻底重悬试管中的磁珠，。

2. 吸取目标体积的磁珠至流式管中，加入同等体积的清洗 Buffer。若不足 1mL，添加 1mL 的清洗 Buffer，涡

旋 5 秒，或使用移液器吹打混匀，注意避免产生气泡（此处也可直接使用细胞培养基清洗）。

3. 将流式管置于磁力架上 3 分钟，弃上清。

4. 重复步骤 2-3，本次使用细胞培养基对磁珠再次清洗。共清洗磁珠两次。

5. 使用细胞培养基重悬磁珠（比如：吸取 25 μL 磁珠进行清洗，清洗后用 1 mL 细胞培养基进行重悬）。

二.人T细胞的激活（以96孔板为例）：

1. 调整 T 细胞浓度为 1 x 10^7 cells/mL，每孔中加入 25 μL T 细胞，此时孔内含有 2.5 x 10^5 个 T 细胞，保持培养基体积为 100 μL。

2. 向孔中加入 100 μL 预处理的磁珠，此时磁珠和细胞的比例为 1：1。（可根据实验需要自行调整磁珠和细胞的使用比例，推荐比例为磁珠：细胞 为1：1。）

3. 将细胞与磁珠置于 37℃，5% CO2培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。

4. 收获激活的 T 细胞，用于下游实验分析。

三.人 T 细胞的扩增 （以分选后人CD3+ T细胞为例）

1. 调整CD3+ T 细胞种板浓度为 1-1.5 x 10^6 cells/mL，按照磁珠与细胞比例 1：1 加入激活磁珠。 

2. 激活 2 天后，向培养基中添加 30 U/mL 的重组人 IL-2。 

3. 细胞与磁珠放于 37℃，5% CO2 培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。 

4. 每日查看细胞激活与扩增情况，注意细胞的大小和形状。当细胞皱缩或增殖速度明显放慢时，提示细胞可能耗竭。 

5. 推荐在细胞激活的前 2 天时不要处理细胞，2 天后随时观察细胞状态，当培养基变黄或孔内细胞数目过多时换液或传代。每次换液或传代后，应及时补充重组人 IL-2 至 30 U/mL。 

6. 定期进行细胞计数，当细胞密度超过 2.5 x 10^6 cells/mL 时，轻柔吹打混匀，将细胞密度调整为 0.5-1 x 10^6 cells/mL。

■ 注意事项

1.操作前需充分混匀磁珠悬液，避免剧烈震荡产生气泡。

2.细胞培养过程中需严格无菌操作，避免污染。

3.磁珠与细胞的比例推荐为1:1，可根据实验需求调整。

4.进行流式检测前，使用磁力架去除磁珠。

5.若培养基浑浊或细胞密度过高（＞2.5×10^6 cells/mL），需及时换液或传代并补充IL-2。

■ 激活效果

使用人 CD3/CD28 T 细胞激活磁珠，刺激 CD3+T 细胞 24到 48 小时，细胞用 FITC anti-human CD69 抗体（克隆号FN50 ）和 PE anti-human CD25 抗体（克隆号 BC96）标记，进行流式细胞仪分析。刺激前后CD25+CD69+ T 细胞占总细胞的比例分别为 0.70% 和 75.81%。