■ 产品描述

小鼠CD8+细胞分选试剂盒（阳选法）适用于从小鼠脾脏细胞或其它组织的单细胞悬液中分选出CD8+细胞。原理是利用 CD8 Capture Antibody 对CD8+细胞进行标记，然后通过 Releasable-Beads 对目标细胞进行捕获，再用 Release Buffer将磁珠从细胞表面解离，从而得到无磁珠标记的小鼠CD8+细胞。分选得到的CD8+细胞可应用于下游的分子生物学和细胞生物学实验。

■ 产品组分

■ 储存条件

2-8°C保存，不可冷冻，有效期见试管标签。

■ 适用范围

本试剂盒适用于分选小鼠淋巴器官，如脾脏和淋巴结中的CD8+细胞。

■ 操作流程

以分选小鼠脾脏CD8+细胞为例：

1. 制备单细胞悬液：在70 μm细胞筛网上研磨脾脏，用预冷的PBS冲洗筛网，收集细胞悬液于50 mL离心管中，500 g离心5分钟。

  注意：研磨时间不宜过长，可控制在1min内，否则可能会有死细胞和细胞碎片干扰。

2. 红细胞裂解：离心结束，弃上清，加入5 mL红细胞裂解液（ACK） ，室温裂解5分钟，再加入20 mL PBS ，500 g离心5分钟。

  注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。

3. 过滤与计数：离心结束，弃上清，将脾细胞重悬于1 mLPBS中，用70 μm细胞筛网过滤后，计数。计数后，500 g离心5分钟。

  注意：细胞悬液需要过细胞筛网，以除去组织和细胞团块，否则会影响后续细胞分选纯度。

4. 制备分选悬液 ：离心结束，弃上清，将细胞重悬于分选buffer中，调整细胞密度为1×10^8 cells/mL。

  注意：分选buffer为含有2% FBS和2mM EDTA的PBS ，缓冲液应该不含Ca2+和Mg2+ ，需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌。

5. 抗体孵育：将500 μL细胞悬液（5×10^7个细胞）加入5 mL无菌流式管底部，加入10 μL CD8 Capture Antibody，轻轻吹打混匀，4℃孵育10 分钟。

  注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入；流式管选用聚苯乙烯材质；根据所使用磁力架特点也可使用离心管进行细胞分选；说明书以5×10^7个细胞量举例，如果分选其他数量细胞，则按比例调整CD8 Capture Antibody用量。

6. 磁珠预处理：涡旋震荡重悬磁珠（Releasable-Beads），吸取100 μL磁珠至1.5 mL离心管，加入1 mL分选buffer，10000 g离心1 min，弃上清。重复洗涤1次。清洗后用100 μL分选buffer进行重悬。

  注意：buffer与磁珠最终是1:1等比例混匀，如清洗100 μL磁珠（Releasable-Beads），则最终用100 μL buffer重悬。

7. 磁珠孵育：加入100 μL清洗过的Releasable-Beads混悬液，轻轻混匀，4℃孵育10分钟。

  注意：说明书以5×10^7个细胞量举例，如果分选其他数量细胞，则按比例调整Releasable-Beads用量。

8. 磁力分离：孵育完成后，在流式管中加入分选 buffer 至分选体系总体积为2.5 mL，混匀后，将流式管置于磁力架上，静置 5 min。

  注意：补buffer时用移液器上下混合吹打5次混匀，操作轻柔，避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀。

9. 重复分离 ：吸出并丢弃上清液。将流式管从磁力架上取下，迅速加入 2 mL 分选 buffer ，用移液器反复吹打分散磁珠后，将流式管置于磁力架上，静置 5 min。

10. 重复步骤9两次。

  注意：彻底的清洗可以保证后续洗脱高纯度的目的细胞。

11.捕获磁珠：磁吸结束后，吸出并丢弃上清液。将流式管从磁力架上取下，迅速加入 1 mL Release Buffer 重悬磁珠，避免磁珠干燥，将磁珠悬液转移至 1.5 mL 离心管中，室温旋转孵育 10 分钟。

  注意：分选其它数量细胞时可则按比例调整 Release Buffer 的用量。

12. 解离磁珠：孵育完成后，用移液器反复吹打至少 10 次，将磁珠悬液转移至一个新的流式管中，补加分选 buffer 至 2.5 mL，吹打混匀，将流式管置于磁力架上，静置 5 分钟。

13.收集目的细胞：手持磁力架，将细胞悬液轻柔倒入无菌15 mL离心管中，此细胞悬液中即包含无磁珠标记的小鼠CD8+细胞。

14.将流式管从磁力架上取下，重复步骤11-13，并将上清液与第一次洗脱后的细胞上清液混合（此为目的细胞悬液）。

15.洗涤与重悬：将目的细胞悬液500 g离心5分钟，弃上清，根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。

■ 注意事项

1.试剂盒各组分使用和保存过程中应避免冷冻；

2.建议选用低吸附移液器吸头和离心管，避免因吸附造成磁珠和抗体的损耗；

3.如果单次分选少于1×10^7 cells，则将细胞悬液体积补至100 μL ，加入2 μL CD8 Capture Antibody、20 μL Releasable-Beads和200 μL Release Buffer。

4.本产品需与磁性分离器配套使用；

5.本产品仅供研究使用。

■ 分选效果

从 C57BL/6 小鼠脾脏细胞中分选 CD8+细胞，用FITC标记的 anti-mouse CD8抗体（克隆号 53-5.8）染色后进行流式细胞分析，分选前后的 CD8+细胞纯度分别为 8.9%和 95.1%。