■ 产品简介

本试剂盒用于细胞凋亡的快速检测。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（Phosphotidylserine，PS）会外翻至细胞膜表面。Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与PS结合。荧光标记的Annexin V可与PS特异性结合，表明该细胞为凋亡细胞。

■ 产品组分

■ 步骤

（一）、样本检测

1.按实验方案诱导凋亡。

2.收集细胞：

a.对于悬浮细胞：在进行完细胞凋亡刺激后，1500 rpm离心5 min，弃上清，收集细胞。用预冷的PBS轻轻重悬细胞，离心沉淀细胞，共洗涤两次。

注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V的结合。

b.对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用，用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1500 rpm左右离心5 min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50 µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入4°C预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。重复洗涤步骤，共洗涤两次。

注：a. 某些将贴壁细胞处理为单个细胞的过程中会造成细胞膜损伤，从而造成Annexin V假阳性。

b.贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色。

3.用去离子水稀释10×Binding buffer为1×工作液，再用1×Binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10^6 cells/mL。

4.吸取100 µL细胞悬液（细胞总数为1-5×10^5 cells）至一新离心管中，加入5 µL Annexin V-FITC，轻柔混匀；再加入5 µL PI solution，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min。

5.加入400 µL 1×Binding buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1小时内检测。

6.根据实验方法，进行流式分析（A）或荧光显微镜检测（B）。

A.流式分析

Annexin V-FITC建议使用FL1通道（最大激发波长为490 nm，发射波长为525 nm，绿色荧光）；PI建议使用FL3通道（最大激发波长为535 nm，发射波长为615 nm，红色荧光）。根据FITC和PI荧光值确定两荧光参数阴阳界限，划定十字门。

B.荧光显微镜检测

a. 将染色后的细胞滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片。

对于贴壁细胞，可将细胞直接种在盖玻片上。在步骤4的染色后，将盖玻片反转盖到载玻片上。观察前可将细胞洗涤并用2%福尔马林固定。（细胞必须在固定前孵育Annexin V-FITC，因为细胞固定后其细胞膜被破坏，会使Annexin V与细胞膜内层的PS结合，产生人为的假阳性。）

b. 使用荧光显微镜上的FITC和罗丹明通道进行观察。

（二）、仪器参数调节

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V-FITC和PI solution。用空白管调节FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。

单染管：阳性对照组细胞，单染管分别加入Annexin V-FITC或PI solution染色，用于调节补偿。

检测管：处理的细胞，加Annexin V-FITC和PI solution，用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

■ 产品保存

4℃保存，Annexin V-FITC和PI solution需避光保存；试剂长期不用放-20℃保存；避免反复冻融。

■ 注意事项

1.Annexin V-FITC和PI染色前，不能用破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或透膜。

2.PI有毒性，能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用，使用时需戴手套。

3.Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。原位染色时，在细胞标记后应在暗室内用荧光显微镜观察。

4.尽量使用不含EDTA的胰酶，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

5.如果样品来源于血液，务必除去血小板。因血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂，在1500 rpm下离心洗去血小板。

整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，以免影响细胞状态。