■ 产品描述

小鼠CD3/CD28 T细胞激活磁珠可以简单快捷的活化及扩增T细胞，无需饲养层细胞（抗原递呈细胞）或抗原。磁珠为直径5 µm的惰性超顺磁珠，大小与抗原呈递细胞相似，同时共价偶联抗CD3和抗CD28抗体。细胞培养过程中可使用重组IL-2刺激T细胞群扩增。活化或扩增后，磁珠可以通过磁力架轻松去除。

■ 规格和组分

■ 储存条件

2-8°C保存，不可冷冻，有效期见试管标签。

■ 适用范围

本试剂盒适用于小鼠脾细胞或T细胞亚群：包括CD3+ T细胞、CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。

■ 实验试剂准备

1.清洗buffer：含2 mM EDTA和2%胎牛血清（FBS）的PBS，或含2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS，需经0.22 μm滤膜过滤除菌。

2.细胞培养基：RPMI 1640 + 10% FBS + 50 μM β-巯基乙醇（可选加入100 U/mL青链霉素双抗）。当需要扩增T细胞时，向培养基内加入30 U/mL重组小鼠IL-2。此外，商品化T细胞培养基同样适用，并且培养基内添加的生长因子可根据实验要求进行调整。

■ 注意事项

1.取用激活磁珠前彻底重悬磁珠（如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟），吹打时避免产生气泡。

2.进行流式检测前，使用磁力架去除磁珠（包括结合在细胞上的磁珠，可以通过轻柔吹打释放磁珠），此时细胞位于上清液中。收集上清液，进行下一步的流式检测。

■ 操作流程：

以分选后小鼠CD3+T细胞为例：

清洗磁珠（以96孔板为例）

1.彻底重悬试管中的磁珠（如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟）。

2.吸取目标体积的磁珠至流式管中，加入同等体积的清洗Buffer（比如：吸取25 μL磁珠进行清洗，25 μL磁珠可用于96孔板的10个孔进行T细胞激活实验）。若使用的磁珠体积不足1 mL，添加1 mL的清洗Buffer，涡旋5秒，或使用移液器吹打混匀，注意避免产生气泡（此处也可直接使用细胞培养基清洗）。

3.将流式管置于磁力架上3分钟，弃上清。

4.重复步骤2-3，本次使用细胞培养基对磁珠再次清洗。共清洗磁珠两次。

5.使用细胞培养基重悬磁珠（比如：吸取25 μL磁珠进行清洗，清洗后用1 mL细胞培养基进行重悬，使用磁珠时，100 μL磁珠悬液加至96孔板的一个孔中）。

小鼠T细胞的激活（以96孔板为例）

6.调整T细胞浓度为1 × 10^7 cells/mL，每孔中加入25 μL T细胞，此时孔内含有2.5 × 10^5个T细胞，再向孔内添加75 μL细胞培养基，保持孔内总体积为100 μL。

7.向孔中加入100 μL清洗后重悬的磁珠，此时磁珠和细胞的比例为1：1，孔内液体总体积为200 μL。使用移液枪轻轻吹打混匀孔内的磁珠和细胞。

8.将细胞培养板置于37℃，5% CO2培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。

9.激活24小时至48小时内，收获激活的T细胞，用于下游实验分析。

小鼠T细胞的扩增

10.按照步骤1-8激活T细胞，在加入磁珠的48小时（即激活2天后）检测T细胞的激活情况。细胞状态良好时，对细胞进行轻柔吹打、传代（若细胞增殖较慢，可先对细胞半换液：小心吸弃100 μL上清液，再向孔内添加100 μL新鲜细胞培养基，轻柔吹打混匀细胞，继续培养1-2天后传代），最后向孔内添加30 U/mL的重组小鼠IL-2。

11.细胞与磁珠放于37℃，5% CO2培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。

12.每日或每隔两日查看细胞扩增情况，小鼠T细胞扩增形态表现为镜下可见的增殖聚团，正常情况下T细胞在激活后第4-12天表现出较快的增殖速度。当细胞皱缩或增殖速度明显放慢时，提示细胞可能耗竭。

注意：在细胞激活的48小时内不要处理细胞，也无需添加重组IL-2。2天后随时观察细胞状态，当培养基变黄或孔内细胞数目过多时换液或传代，并添加重组IL-2。每次换液或传代后，应及时补充重组IL-2至30 U/mL。（推荐定期进行细胞计数，当细胞密度超过2.5 × 10^6 cells/mL时，轻柔吹打混匀，将细胞密度调整为0.5-1 × 10^6 cells/mL）

■ 激活效果：

使用小鼠CD3/CD28 T细胞激活磁珠，刺激CD3+ T细胞24到48小时，细胞用FITC anti-mouse CD69抗体（克隆号H1.2F3）和PE anti-mouse CD25抗体（克隆号PC61）标记，进行流式细胞仪分析。刺激前后CD25+CD69+ T细胞占总细胞的比例分别为0.81%和45.70%。